逐渐习惯了现代生活的美国队长史蒂夫·罗杰斯（克里斯·埃文斯 Chris Evans 饰），在一次举动后隐约嗅到神盾局内部所充满出来的阴险气味。而当得知神盾局正隐秘进行的“洞悉方案”后，他更为此感到愤恨。某天，神盾局指挥官尼克-法瑞（塞缪尔·杰克逊 Samuel L. Jackson 饰）遭到一群装备分子突击，他拼尽全力将一支U盘交到美国队长手中，这里边藏着该局二战以来最重要且最可怕的隐秘。在此之后，美国队长因涉嫌杀害尼克而遭到前局长亚历山大·皮尔斯（罗伯特·雷德福/Robert Redford 饰）的通缉和追杀，流亡中他得到黑寡妇（斯嘉丽·约翰逊 Scarlett Johansson 饰）和退伍老兵“猎鹰”（安东尼·麦凯 Anthony Mackie 饰）的协助。 
他们有必要分秒必争解开神盾局的隐秘，阻挠“洞悉方案”的施行……